人参皂苷Rh2对胃癌细胞SGC/ADR耐药敏感性的影响
胡双双1，闫克敏1，王娇娇1，郭萌2，帖君2，聂勇战2，肖海娟2,3*
1.陕西中医药大学，陕西咸阳
2.第四*医院，陕西西安
3.陕医院肿瘤科，陕西咸阳
摘要：目的观察人参皂苷Rh2（G-Rh2）对人胃癌SGC/ADR耐药细胞增殖、细胞周期及化疗敏感性的影响。方法MTT法检测G-Rh2与阿霉素（ADR）联用对SGC/ADR细胞增殖的影响，并计算逆转倍数（RF）；流式细胞术检测G-Rh2对SGC/ADR细胞周期的影响；蛋白印迹法检测G-Rh2对SGC/ADR细胞P-糖蛋白（P-gp）、Bcl-2蛋白表达水平的影响。结果与ADR单药处理后细胞的半数抑制浓度（IC50）值（54.52μmol/L）比较，G-Rh2与ADR联用时SGC/ADR细胞IC50值（30.14μmol/L）明显下降，RF为1.81；G-Rh2与ADR联用能够将SGC/ADR细胞周期阻滞在G2/M期，与ADR单药处理比较，联用组细胞P-gp、Bcl-2的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。结论G-Rh2联合ADR能够提高SGC/ADR细胞的化疗敏感性，可能通过阻滞细胞周期、增加细胞凋亡进而抑制细胞增殖。
关键词：人参皂苷Rh2；SGC/ADR细胞；阿霉素；耐药；化疗敏感性
中图分类号：R.5文献标志码：A文章编号：-()17--05
据年发表的中国癌症数据统计，胃癌在所有恶性肿瘤中发病率居第2位，死亡率居第3位[1]。化疗是目前中晚期胃癌的主要治疗手段，但由于原发性或继发性耐药常导致化疗的失败[2]。胃癌耐药机制复杂，目前研究发现的主要有增加药物外排[3]、增加DNA损伤修复[4-5]、抑制细胞凋亡[6]、激活异常信号通路[7]、缺氧诱导因子-1α异常表达[8]等。因此，如何解决多药耐药问题已成为胃癌治疗的关键。人参皂苷Rh2（ginsenosideRh2，G-Rh2）是人参有效成分之一，研究发现其具有抗过敏调节免疫、改善心肌缺血、抗抑郁、抗肿瘤等众多作用[9]。作为人参皂苷中抗肿瘤功效最好的单体成分[10]，G-Rh2抗肿瘤作用已成为研究热点，但多集中于敏感细胞系，近年来有研究发现G-Rh2可以逆转肿瘤细胞的耐药性，增加耐药细胞对化疗药物的敏感性[11-13]。本实验以胃癌耐药细胞为研究对象，探讨G-Rh2对胃癌耐药细胞的逆转作用，为胃癌的临床治疗提供理论依据。
1材料
1.1药品及试剂
G-Rh2（批号，规格20mg，质量分数＞98%）购自中国食品药品检定研究院。阿霉素（ADR，批号D，规格10mg，质量分数≥98%）购自美国Sigma公司。二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、β-actin抗体均购自美国Sigma公司；P-糖蛋白（P-gp）抗体购自美国CST公司；Bcl-2抗体购自美国Abcam公司；辣根酶标记的二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RPMI培养基、0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；PBS购自美国Corning公司；胎牛血清购自以色列BI公司。
1.2细胞株
人胃癌SGC细胞及耐药细胞SGC/ADR均来源于第四*医院肿瘤生物学国家重点实验室。
2方法
2.1G-Rh2和ADR药液的制备
取μLDMSO将20mgG-Rh2充分溶解[14]，配制成μmol/L储存液，于?20℃避光保存，使用时用PBS稀释（DMSO体积分数＜0.1%）。取PBS缓冲液将ADR充分溶解，制成μmol/L储存液，于?20℃避光保存，使用时用RPMI培养液稀释到相应浓度。
2.2细胞培养
SGC细胞与SGC/ADR细胞用含10%胎牛血清及1%双抗（青、链霉素）的RPMI培养液培养，3～4d传1代。SGC/ADR细胞用0.86μmol/LADR维持其耐药性，实验前1周撤药。
2.3MTT法检测G-Rh2联合ADR对SGC/ADR细胞耐药的逆转作用
取对数生长期的SGC/ADR细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，重悬细胞沉淀，取10μL至细胞计数板读取细胞浓度，取3次平均值。将细胞密度调整为5×个/mL，接种于96孔板培养。分为空白组（只加培养基）、对照组（加入等量细胞及培养基）、实验组（设8、16、32、64、96μmol/L5个浓度梯度的G-Rh2及6.5、12.9、25.9、51.7、.5μmol/L5个浓度梯度的ADR），G-Rh2组每组设3个复孔，ADR组每组设5个复孔。待细胞贴壁后，按上述分组加药，放入37℃、5%CO2细胞培养箱培养48h。每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h，终止培养，弃培养液，每孔加入μLDMSO，震荡10min，于酶标仪nm波长下检测吸光度（A）值，计算G-Rh2非*性剂量[15]（对细胞抑制率≤20%的药物浓度），以及ADR的半数抑制浓度（IC50），绘制细胞生长曲线，实验重复3次。
细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白)
选择G-Rh2最大非*性剂量（20%细胞抑制浓度，即80%细胞存活的药物浓度13.6μmol/L）联合不同浓度ADR（浓度同上）作用于SGC/ADR细胞。酶标仪nm波长下检测A值，绘制细胞生长曲线。计算G-Rh2与ADR联用时对细胞的IC50值，确定细胞逆转倍数（RF）。
RF＝不加G-Rh2时对细胞的IC50值/加入G-Rh2时对细胞的IC50值
2.4流式细胞术检测细胞周期
取处于对数生长期的SGC/ADR细胞，将细胞浓度调整为4×个/mL，铺6孔板。将细胞分为对照组（加等量细胞及培养基）、G-Rh2组（13.6μmol/L）、ADR组（27.3μmol/L）、联用组（13.6μmol/LG-Rh2＋27.3μmol/LADR）。细胞贴壁后，按上述分组加药作用72h。终止培养，消化细胞，r/min离心5min，取得细胞沉淀。加2mLPBS重悬细胞沉淀，r/min离心5min，重复2次。弃上清，加入1mLPBS和2mL无水乙醇固定4h。流式细胞仪检测，实验重复3次。
2.5Westernblotting实验检测
G-Rh2联合ADR对SGC/ADR细胞P-gp、Bcl-2蛋白表达的影响取对数生长期SGC、SGC/ADR细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，分别铺皿培养。分为对照组和加药组，对照组为SGC细胞及SGC/ADR细胞。加药组均为SGC/ADR细胞，分为G-Rh2组（13.6μmol/L）、ADR组（27.3μmol/L）、联用组（13.6μmol/LG-Rh2＋27.3μmol/LADR）。加药作用72h后，提取蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。配制10%SDS-PAGE凝胶，各取20μg蛋白进行凝胶电泳（30mA恒流），采用湿转法（mA，min）将蛋白转移至NC膜，5%脱脂牛奶常温封闭1h，孵育一抗（P-gp1∶，Bcl-21∶），置于4℃摇床过夜。TBST缓冲液漂洗条带，二抗（1∶0稀释）常温孵育1h，TBST缓冲液漂洗后进行显影。采用ImageLab软件分析图像。实验重复3次。
2.6统计学分析
采用SPSS19.0统计软件以及Graphpad6.01作图软件进行数据处理，数据用x±s表示，组间比较采用t检验。
2.6统计学分析
采用SPSS19.0统计软件以及Graphpad6.01作图软件进行数据处理，数据用x±s表示，组间比较采用t检验。
3结果
3.1G-Rh2与ADR联用浓度的确定
如图1所示，用不同浓度G-Rh2作用SGC/ADR耐药细胞，G-Rh2浓度为8μmol/L时，细胞存活率在80%以上，G-Rh2浓度为16μmol/L时，细胞存活率低于80%。选择药物对细胞的最大非*性浓度，即80%细胞存活时的药物浓度作为与化疗药ADR联用浓度，计算G-Rh2对耐药细胞的最大非*性浓度，最终确定该浓度为13.6μmol/L。
图1不同浓度G-Rh2对SGC/ADR细胞存活率的影响(x±s,n=3)
Fig.1EffectofG-Rh2onsurvivalrateofSGC/ADRcells(x±s,n=3)
3.2G-Rh2联合ADR对SGC/ADR细胞耐药的逆转作用
通过对比不同浓度ADR单用及与13.6μmol/LG-Rh2联用处理细胞48h后对细胞生长的影响，分别计算药物对细胞的IC50值。如图2所示，ADR联用G-Rh2后，细胞存活曲线明显左移，细胞存活率下降。单用ADR处理细胞计算得到其IC50值为54.52μmol/L，而ADR与G-Rh2联用时对细胞的IC50值为30.14μmol/L，二者相比较具有统计学意义（P＜0.）。并计算G-Rh2联合ADR对SGC/ADR细胞的RF值为1.81。选择27.3μmol/L（单用时1/2IC50值）作为后续实验中ADR浓度。
图2G-Rh2联合不同浓度ADR对SGC/ADR细胞存活率的影响(x±s,n=5)
Fig.2EffectofG-Rh2