人参皂苷Rh2增强紫杉醇诱导Hela细胞的凋亡
焦玉莲1,王强修1,李建峰1,王振华2
1.医院(中心实验室:焦玉莲;病理科:王强修,李建峰),山东济南
2.石河子大学药学院省部共建教育部*特种植物药资源重点实验室,*石河子
中华肿瘤防治杂志,,13(21):-
摘要目的:探讨人参皂苷Rh2能否增强紫杉醇诱导Hela细胞的凋亡。方法:应用SRB法检测药物抑肿瘤效应;荧光染色和流式细胞仪检测细胞凋亡;应用金氏公式分析药物间的相互作用。结果:人参皂苷Rh2可浓度依赖性地抑制Hela细胞的增殖,并可协同性地增强紫杉醇对细胞增殖的抑制作用;人参皂苷Rh2可协同性地增强紫杉醇诱导的Hela细胞凋亡,并具有浓度依赖性。结论:人参皂苷Rh2可协同性地增强紫杉醇对Hela细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用。
关键词人参皂苷/药理学;紫杉酚;Hela细胞;细胞凋亡/药物作用
GinsenosideRh2potentiatespaclitaxelinducedapoptosisinHelacells
JIAOYulian1,WANGQiangxiu1,LIJianfeng1,WANGZhenhua2
1.ShandongProvincialHospital,Jinan,,P.R.China
2.KeyLaboratoryofPhytomedicineResourcesModernizationofTCM,SchoolofPharmaceutical,ShiheziUniversity,Shihezi,,P.R.China
[ABSTRACT]OBJECTIVE:ToexplorewhetherginsenosideRh2wasabletoenhancethepaclitaxelinducedapoptosisinHelacells.METHODS:TheinhibitoryeffectonHelacellsproliferationwasdetectedbySRBassay;Apoptosiswasdeterminedviafluorescencestainingandflowcytometry;TheinteractionbetweenginsengsaponinRh2andpaclitaxelwasanalyzedbymeansofJin!sformulation.RESULTS:GinsenosideRh2inhibitedtheHelacellsproliferationinaconcentrationdependentmannerandsynergisticallyenhancedtheinhibitoryeffectofpaclitaxel.Furthermore,ginsenosideRh2wasabletosynergisticallyincreasetheapoptosisinducedbypaclitaxelinaconcentrationdependentway.CONCLUSION:GinsenosideRh2interactedsynergisticallywithpaclitaxeltopotentiateitsproapoptoticeffectonHelacells.
[Keywords]ginsenoside/pharmacology;paclitaxel;Helacells;apoptosis/drugeffects
子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一。近年来,随着肿瘤化学治疗研究的迅速发展,紫杉醇被逐步应用于宫颈癌的同步放化疗或辅助治疗,获得了理想的效果[1]。但对于晚期已转移或复发的宫颈癌患者而言,目前的治疗仍未有较大进展。研究表明,人参皂苷Rh2可以诱导肿瘤细胞再分化和凋亡[2,3]。我们利用体外培养的Hela细胞系,探讨了人参皂苷Rh2和紫杉醇单用或联用对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。
1材料与方法
1.1材料与仪器
人子宫颈癌Hela细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心;人参皂苷Rh2由山东省天然药物工程技术研究中心提供,纯度为99.1%;RPMI培养基为GIBCOBRL公司产品;类标准胎牛血清,兰州民海生物工程有限公司产品;紫杉醇(Paclitaxel,Taxol),SulphorhodanminB(SRB)、碘化丙啶(PI)、吖啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)为SIGMA公司产品。SynergyHT多功能酶标仪,美国BIOTEK;TE倒置荧光显微镜,日本Nikon;Facscalibur流式细胞仪,美国BD。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养Hela细胞以3:mL-1接种在含10%小牛血清、U/mL青霉素和mg/mL链霉素的RPMI培养基中,于37℃、5%CO2,饱和湿度下培养。
1.2.2药物对细胞增殖的抑制作用以SRB法对药物抑制细胞增殖作用进行测定[4]。处于对数生长期的细胞以胰酶消化后,重悬于培养液,调整细胞浓度为1：mL-1。于96孔板中每孔加入mL细胞悬液,于培养箱内培养24h。弃去原培养液,每孔加入??L含不同浓度药物的培养液,于CO2培养箱中继续培养48h。培养结束后,每孔中加入50%三氯醋酸50mL,静置5min后,置于4℃冰箱冷藏1h。弃去培养板内液体,以去离子水洗涤5遍,空气中干燥。每孔加入mL0.4%的SRB溶液(溶于1%乙酸),静置20min。弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍,去除未结合的染料,空气中干燥后用pH为10.5的10mmol/L非缓冲Tris碱液mL溶解结合的染料。于微孔板振荡器上振荡10min,使结合的染料充分溶解,于SynergyHT多功能酶标仪上读取各孔吸光度,测定波长为nm。根据各孔吸光度计算药物对细胞增殖的抑制率。增殖抑制率(%)=(1-含药OD平均值对照孔OD平均值)%。
1.2.3凋亡细胞形态观察细胞培养于48孔板,紫杉醇和Rh2单独或联合处理48h后,于培养液内加入吖啶橙和溴化乙啶溶液各20mL,使其终浓度均为20mg/mL,轻轻摇晃以混匀,静置5min,轻轻吸去培养板内液体,于倒置荧光显微镜(NikonTE,)观察细胞并拍照[5]。
1.2.4凋亡的流式测定细胞培养于6孔板,紫杉醇和Rh2单独或联合处理48h后,以0??%胰酶消化收集各孔细胞,PBS洗涤2次,制成1：mL-1的悬液,将细胞悬液滴入预冷(-20℃)的70%乙醇中固定,4过夜,次日洗去乙醇,用含有0.1%TritonX、0.1mmol/LEDTA和5mg/mLPI的PBS溶液染色,同时加入U/mL的RNase,室温暗处培育30min,洗去PI,重新悬浮,染色后0.5h内上机,用Cellquest(Version1.2.2)软件获取00个细胞并分析凋亡细胞[6]。
1.2.5药物相互作用分析??采用金正均概率和法[7]。对人参皂苷Rh2和紫杉醇联合应用对Hela细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡结果进行计算。q=ER+TER+ET-ER?ETER、ET和ER+T分别表示单独应用人参皂苷Rh2或紫杉醇或两者联合应用对细胞增殖抑制百分率或诱导的凋亡百分率。q=1表示两药作用为相加,q1表示两药作用为协同,q1表示两药作用为拮抗。
1.3统计学处理
每实验均重复3次,实验结果以x-%s表示。采用SPSS9.0软件包以单因素方差分析(ANOVA)进行组间差异比较.
2结果
2.1紫杉醇和人参皂苷Rh2对Hela细胞增殖的抑制作用人参皂苷Rh2可浓度依赖性地抑制Hela细胞的增殖,抑制曲线呈典型S型曲线,IC50为(49.28%2.39)mg/mL(图1)。紫杉醇单独应用或与10、20和40??g/mL的人参皂苷Rh2联合应用对Hela细胞增殖抑制曲线见图2。表明紫杉醇浓度依赖性的抑制了Hela细胞的增殖,IC50为(0.%0.)mg/mL。10、20和40mg/mL的人参皂苷Rh2与紫杉醇联合应用,可明显增强紫杉醇对Hela细胞增殖的抑制作用,使紫杉醇的IC50下降为(0.%0.)、(0.%0.)和(0.%0.)mg/mL。根据金氏计算公式计算各浓度联合用药q值,结果q值均1,表明人参皂苷Rh2和紫杉醇联合应用对Hela细胞增殖的抑制有协同作用。
Hela细胞培养于96孔板,以不同浓度人参皂苷Rh2处理48h后,SRB法测定增殖活性.
图1人参皂苷Rh2对Hela细胞增殖抑制曲线
Hela细胞培养于96孔板,以10、20或40mg/mL人参皂苷Rh2与不同浓度紫杉醇联合处理48h后,SRB法测定增殖活性。
图2人参皂苷Rh2与紫杉醇联用对Hela细胞增殖抑制曲线
2.2人参皂苷Rh2促进紫杉醇诱导Hela细胞的凋亡利用AO和EB双染进行荧光观察。0.02mg/mL紫杉醇和20??g/mL人参皂苷Rh2处理48h后均可见到少量早期凋亡细胞,而两者联合处理后,凋亡细胞数量明显增多,且有较多晚期凋亡细胞出现(图3)。流式细胞术测定结果表明,紫杉醇和人参皂苷Rh2均剂量依赖性地诱导了Hela细胞凋亡的发生,紫杉醇和人参皂苷Rh2联合应用,细胞凋亡比率明显升高。根据金氏公式计算的q值表明,10、20和40mg/mL人参皂苷Rh2和0.02mg/mL紫杉醇联合应用诱导的Hela细胞凋亡有协同增效作用(表1)。
3讨论
人参作为传统中药在中国的应用已有数千年的历史,具有广泛的药理活性。人参皂苷是人参的主要有效成分之一,人参中多种天然存在的人参皂苷如Rb1、Rg3均可在肠道菌群的代谢下产生Rh2进入循环系统[8,9]。紫杉醇是一种通过抑制微管蛋白解聚,阻滞细胞周期于G2/M期,从而导致癌细胞死亡的广谱抗肿瘤药物,临床上以单药或与其他化疗药联合应用对多数实体瘤有效。Yim等[10]的研究表明,人参皂苷Rh2和紫杉醇均可以通过caspase3裂解CDC6蛋白诱导Hela细胞发生凋亡。CDC6是DNA复制起始和延伸的首要因子,是形成前复制复合物的主要成分,是确保细胞在一个细胞周期中只复制一次的重要因子,肿瘤细胞中存在高表达的CDC6蛋白。这表明人参皂苷Rh2和紫杉醇可能通过一条共同的信号通路诱导Hela细胞凋亡,有可能是两者具有协同作用的基础。
Mo等[11]的研究发现,紫杉醇可诱导肿瘤细胞端粒缩短并发生凋亡,抑制端粒酶活性,可明显增强紫杉醇诱导肿瘤细胞的凋亡。曾小莉等[12]的研究表明,人参皂苷Rhmg/mL时可明显抑制肝癌细胞端粒酶活性,并诱导了肝癌细胞的再分化;而Hela细胞为端粒酶阳性细胞。因此,人参皂苷Rh2对端粒酶活性的影响也有可能是其增强紫杉醇诱导的Hela细胞凋亡的机制之一。
我们的研究表明,人参皂苷Rh2可剂量依赖性地抑制Hela细胞增殖,诱导Hela细胞凋亡,并可明显促进紫杉醇对Hela细胞增殖的抑制作用。荧光显微镜形态学观察和流式细胞测定结果表明,人参皂苷Rh2促进了紫杉醇诱导Hela细胞的凋亡。
我们的研究虽在细胞水平揭示了人参皂苷Rh2可协同促进紫杉醇对Hela细胞增殖抑制和诱导凋亡作用,但具体分子机制和体内的作用仍需进一步研究。人参皂苷Rh2本身具有一定的抗肿瘤活性和免疫调节作用,且具有增强紫杉醇活性的作用,如能应用于临床,有可能使宫颈癌患者受益。
参考文献
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