摘要：目的探究温度调控对人参皂苷积累及其合成途径关键酶基因表达量的影响。方法以培养23d人参愈伤组织为实验材料，置于5、10、15、20、25、30℃6个培养箱中恒温培养，每天取样1次连续取样8d，测定干、鲜质量和皂苷含量，确定响应敏感温度，以GAPDH为内参基因，real-timePCR检测皂苷合成途径中9个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR2）、法尼基焦磷酸合成酶（FPS）、角鲨烯合成酶（SS1）、角鲨烯环氧酶（SE1）、达玛烷二醇合成酶（DS-Ⅱ）、β-香树素合成酶（PNY1）、β-香树素C-28位羟基化酶（CYPA52v2）、原人参三醇合成酶（CYPA53v2）、原人参二醇合成酶（CYPA47）基因表达量。结果20℃为人参愈伤组织干、鲜质量积累最佳温度，5、10、15℃皂苷含量2～3d达到最大值，5℃为人参皂苷积累响应敏感温度，与对照组差异显著，人参皂苷Re、Rg1和总皂苷分别为对照组1.93、11.93和1.54倍。HMGR2、SS1、DS-Ⅱ、SE1和CYPA52v2基因表达量在低温2～4d均达最大值，为对照组2.8、1.6、3.5、3.7和3.8倍。相关性分析发现SE1与人参皂苷Re、Rg1和总皂苷呈显著正相关关系。结论适度的低温有利于人参皂苷的快速积累，SS1、DS-Ⅱ、SE1、HMGR2、CYPA52v2为响应低温的关键基因，在人参皂苷生物合成抵御低温的过程中发挥重要作用。
人参PanaxginsengC.A.Mey.为五加科多年生宿根草本植物，珍贵中药材，应用历史悠久，有“百草之王”的美誉。人参皂苷为其主要药效成分，按苷元基本骨架分为齐墩果烷型和达玛烷型，均为三萜类化合物，目前已从人参中分离得到了约种人参皂苷单体[1-4]，人参皂苷在调节免疫力、抗压抗疲劳、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血糖、保肝护肝等方面有很好的功效[5-7]，具有很高的医学价值和商业价值[8]。环境因素影响人参产地的分布、生长、产量和品质，不同的生态因素形成了典型的药材道地性。生态环境严重影响了人参皂苷的生物合成及其合成途径中关键酶基因的表达，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）法尼基焦磷酸合成酶（FPS）、角鲨烯合成酶（SS）角鲨烯环氧酶（SE）、达玛烷二醇合成酶（DS）、β-香树素合成酶（AS）、细胞色素P是人参皂苷生物合成途径的关键酶基因，在人参皂苷生物合成途径中具有关键作用[9]。
人参野生资源较少，而人工栽培的人参皂苷含量差异较大，无法满足人们的市场需求，严重影响了人参的药用价值。现已广泛采用细胞和组织培养的方法解决这一问题，该方法具有时间段、效率高、稳定性强等特点，已成为获得药用植物药效成分有效方法之一，并得到广泛的应用。温度是组织培养过程中重要的控制条件之一，温度因子对植物有着重要的生态作用[10]，有研究表明，植物积累次生代谢产物所需的生境与其生长发育的适宜条件可能并不一致，甚至相反，道地药材的产生与特定生境密切相关[11]，该生境通常会表现出某种逆境特征[12]。目前关于温度调控人参中人参皂苷积累及其合成途径关键酶基因表达的影响研究较少，本研究通过分析不同培养温度下人参愈伤组织中人参皂苷积累的动态变化规律，并结合其合成途径关键酶基因表达的变化，进而阐释人参皂苷生物合成对温度调控响应的分子机制，为进一步揭示人参皂苷生物合成的生理生态机制奠定理论基础。
1材料与试剂
1.1材料
人参愈伤组织来源于吉林抚松二年生人参根，经长春中医药大学药学院齐伟辰副教授鉴定为人参PanaxginsengC.A.Mey.。
1.2仪器与试剂
对照品人参皂苷Rg1、人参皂苷Re购自上海源叶生物科技有限公司（质量分数≥98%），娃哈哈矿泉水，甲醇、乙腈（FisherScientific公司），甲醇（萃取剂）及其他试剂均为国产分析纯，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR?PremixExTaqTM染料等购自大连宝生物。
Agilent高效液相色谱仪（美国Agilent公司），ImplenNanophotometerP超微量核酸蛋白检测仪（德国Implen公司），MDF-E超低温冰箱（日本SANYO公司），MxP荧光定量PCR仪（美国Aligent公司）。
2方法
2.1组织培养
选取继代培养长势良好的愈伤组织进行继代培养，培养条件如下：20℃暗培养，MS基础培养基，添加4%琼脂，0.3mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），0.5mg/mLVc（L-抗坏血酸），每瓶继代接种量（鲜质量）约为2.0g，暗培养于20℃的培养箱，培养至23d开始将其分别置于5、10、15、20（对照组）、25、30℃6个培养箱中暗培养，控制除温度外的其他生长环境条件相一致，从温度调控的第1天开始取样，连续取样8d，每次每个温度取样30瓶，其中5瓶经液氮速冻后，?80℃冰箱保存，用于基因表达量检测，另外25瓶测定愈伤组织生长量及皂苷含量。
2.2人参皂苷含量检测
人参愈伤组织称取鲜质量后，55℃烘干至恒定质量，用研钵研磨成粉末，过40目筛备用。每个样品精密称取0.5g，加入30mL甲醇，90Hz超声提取30min，将上层清液滤过，重复3次，合并滤液，转移置蒸发皿中60℃水浴蒸发，定容至1mL棕色量瓶，过0.22μm针孔滤器，用于HPLC检测。每个样品3次重复。色谱条件：Agilent高效液相色谱系统，色谱柱：依利特HypersilODS2（mm×4.6mm，5μm）。流动相组成为乙腈（A）-水（B）。洗脱条件：0～16min，19%～23%A；16～25min，23%～28%A；25～35min，28%～70%A；35～45min，70%A。进样量10μL，柱温25℃，检测波长nm，体积流量1.0mL/min。本研究检测了人参愈伤组织中11个单体皂苷，仅检测到2种单体皂苷（人参皂苷Rg1和人参皂苷Re），总皂苷为2种单体皂苷的总和。
2.3荧光定量PCR(Real-timePCR)
取?80℃保存的人参愈伤组织，于液氮预冷的研钵中充分研磨，按照Takara植物通用总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，ImplenNanophotometerP检测RNA浓度及纯度。将检测合格的总RNA按照Takara反转录试剂盒说明书进行反转录，将反转录得到的cDNA存放于?20℃冰箱备用。内参基因和特异性引物序列见表1，采用SYBR染料法，以cDNA为模板，根据表2中的引物序列，反应体系如下：ddH2O7.0μL，SYBRPremixExTaqTM10μL，正反引物各1.0μL，cDNA模板1.0μL，共20μL。PCR反应程序为95℃预变性30s；40个循环（95℃变性5s；55℃退火32s），72℃退火，延伸20s；采用2?△△Ct法进行实时荧光定量PCR结果的计算，计算目的基因的相对表达量，其中ΔΔCt＝（实验组目的基因的Ct值－实验组内参基因的Ct值）－（对照目的基因的Ct值－对照组内参基因的Ct值）。
2.4数据处理
利用Excel对原始数据进行汇总整理，采用DPS进行单因素方差分析及相关性分析；并采用GraphPadprism6.0进行图形绘制。
3结果与分析
3.1温度对人参愈伤组织生物量的影响
温度调控对人参愈伤组织鲜质量和干质量的影响如图1-A、1-B所示，20℃为人参愈伤组织的最佳培养温度。不同培养温度下人参愈伤组织干质量和鲜质量的变化趋势基本一致，各培养温度之间干质量和鲜质量差异显著，对照组（20℃）培养条件下的干质量和鲜质量的峰值均出现在温度调控的第7天，而其他温度调控下愈伤组织干质量和鲜质量的峰值均有不程度的提前。对照组培养下的愈伤组织鲜质量和干质量的峰值为11.21、0.41g。5、10、15、25、30℃的鲜质量峰值分别为对照组（20℃）的71.19%、72.88%、77.44%、84.76%、78.61%，而干质量峰值分别为对照组（20℃）的71.50%、74.63%、80.52%、88.32%、87.70%。结果表明，20℃为人参愈伤组织生长的适宜温度，温度过高或者过低均不利于人参愈伤组织生长。
3.2温度调控对人参愈伤组织中皂苷含量的影响
温度调控下人参愈伤组织中皂苷含量差异显著，变化如图2所示，由于人参愈伤组织生长周期短，次级代谢产物积累量较少，本实验只检测到了人参皂苷Rg1和人参皂苷Re。20℃处理下人参皂苷
Rg1、Re和总皂苷含量呈现逐渐上升的趋势，其他温度调控下呈现先升高后下降的趋势，对照组人参皂苷Re在第8天出现最大值0.mg/g，5℃处理的最大值（0.mg/g）出现在2d，为对照组1.93倍，10℃处理的最大值（0.mg/g）出现在调控4d，15℃处理最大值（0.mg/g）出现在5d，而25、30℃处理最大值在8d，分别为0.、0.mg/g（图2-A）。如图2-B所示为温度调控下人参皂苷Rg1的变化趋势，与人参皂苷Re相似，对照组人参皂苷Rg1最大值（0.mg/g）在8d，5℃最大值（0.mg/g）在3d，为对照组11.93倍，10℃最大值（0.mg/g）在4d，15℃最大值（0.mg/g）在5d，而25℃和30℃最大值均在8d，分别为0.mg/g和0.mg/g。如图2-C所示为温度调控下人参愈伤组织总皂苷变化情况，总皂苷变化与人参皂苷Re和人参皂苷Rg1基本相同，5℃最大值（3.mg/g）在3d，为对照组1.54倍，以上结果均可以显示出适当低温使人参皂苷积累的峰值提前，可促进人参皂苷快速合成积累。
3.3温度对人参皂苷合成途径关键酶基因表达量的影响
综合分析温度调控下人参皂苷含量和干鲜质量变化，确定5℃为人参愈伤组织响应敏感温度，因此选择5℃（处理组）和20℃（对照组）为试验材料，分析温度调控下人参皂苷合成途径关键酶基因表达量变化。温度调控对人参愈伤组织中关键酶基因表达量的影响如图3所示。HMGR2、SS1、SE1、DS-II和CYPA52v2基因在低温调控下出现先逐渐升高后降低的变化趋势，SS1和DS-II基因于处理2d达最大值，随后逐渐降低，分别为对照组1.6、3.5倍，SE1和CYPA52v2基因处理3d达最大值，分别为对照组的3.7、3.8倍，HMGR2基因处理4d后达最大值，为对照组2.8倍。说明不同基因在低温调控下的表达存在明显的滞后性，响应低温的时间不同，而FPS、PNY1、CYPA53v2和CYPA47基因的表达量在低温调控下与对照组的变化趋势相同，差异不显著。
3.4温度调控下人参愈伤组织中合成关键酶基因表达量与人参皂苷相关性分析
温度调控下人参愈伤组织中关键酶基因表达量与人参皂苷相关性分析结果如表2所示，总皂苷与人参皂苷Re、SE1和CYPA53v2呈极显著正相关关系（P＜0.01），与人参皂苷Rg1、FPS和DS-II均呈现正相关关系（P＜0.05），人参皂苷Re与HMGR2、SS1和SE1呈显著正相关关系（P＜0.05），人参皂苷Rg1与SE1呈显著正相关关系（P＜0.05）。
4讨论
次生代谢产物的生物合成受到遗传因素（如种质资源）和环境因素（如温度、水分、光照、土壤等）的共同作用。有研究表明，药用植物生长发育的最适环境与药用植物药效成分积累的最适环境不同[13-15]。低温条件下，植物通过改变外部形态以适应低温环境，与此同时，激活次级代谢产物合成途径关键酶基因表达，植物快速积累次生代谢产物来抵御低温条件带来的损伤[16]。本实验通过温度调控，对人参愈伤组织生长、皂苷含量和关键酶基因表达量进行研究，为阐释人参皂苷生物合成对温度调控的响应机制研究奠定理论基础。
本研究发现低于或高于对照组（20℃）的培养温度均不利于人参愈伤组织鲜质量和干质量的积累，20℃为人参愈伤组织培养的最适温度。愈伤组织中单体皂苷与总皂苷之间变化趋势相同，有研究表明，皂苷之间存在协同增减趋势[17-18]，与本研究结果一致。低于20℃的培养温度均可以使愈伤组织中人参皂苷快速积累峰值具有一定程度的提前，5℃培养的总皂苷含量最大值高于20℃最大值，这结果与You等[19]和Jiang等[20]的结果相一致，适度的低温有利于人参皂苷的积累，温度过高不利于人参皂苷的积累。虽然低温5℃处理人参愈伤组织生物量积累较低，但其具有最大的人参皂苷积累量，并且人参皂苷积累的最大值提前，缩短了培养时间，从工业生产角度考虑，短时低温处理可有效的提高次生代谢产物的积累，节约成本，为人参皂苷工业化生产技术的创新提供理论参考。
目前，人参皂苷的生物合成途径几乎全部明晰，有研究表明，合成途径的关键酶基因在抵御低温过程中具有着重要作用[21]。本研究选择人参皂苷生物合成途径上、中、下游9个基因为研究对象，其中SS1和DS-II在低温第2天基因表达量最大值为对照组基因表达量的1.6和3.5倍，与人参皂苷变化趋势相同，这与林红梅研究[22]结果相一致。SE1、HMGR2、CYPA52v2在低温处理第3、4天基因表达量最大值为对照组的3.7、3.8、2.86倍，说明基因表达量存在一定的滞后性，与张涛研究结果相一致[23]，SS1、DS-Ⅱ、SE1、HMGR2、CYPA52v2为响应低温的关键基因，说明其在人参皂苷生物合成响应低温过程中发挥重要作用，同时进行相关性分析发现，SE1与皂苷呈显著正相关关系，SE1可作为重点响应低温的关键基因。以上研究为阐释人参皂苷生物合成对温度调控响应的分子机制，揭示人参皂苷生物合成的生理生态机制奠定理论基础。
参考文献（略）
来源：张涛，*，张维维，陈湘，张庆贺，刘芳馨，李卓然，齐伟辰．温度调控对人参皂苷积累及其关键酶基因表达的影响[J].中草药,,51(19):5-.
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